拓展阅读 ： DMD基因型-表型复杂性
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1998年，European Journal of Paediatric Neurology杂志发表的一项研究中，作者报道了3个DMD 基因致病突变家系。在这3个家系中分别存在DMD 基因的外显子 "32-44"、"48-51"、"48-53"缺失，且每个家系中皆有大于40岁男性携带该缺失。然而，所有家系成员均无相关临床症状或症状很轻微，严重者仅表现为轻度脊柱侧弯或肌肉萎缩 [2] 。
2016年, Journal of Human Genetics杂志上发表的一项研究中，作者报道了1例DMD基因外显子3-9缺失的男性患者。他在12岁时血浆肌酸激酶(CK)轻度增高，15岁时肌活检确诊BMD，但身体活动上并无明显临床症状。到了21岁时心脏功能轻微异常，使用β阻滞剂治疗后无异常，随访至27岁无任何肌肉问题，因此作者提出假设：此外显子缺失可能会产生一种功能蛋白，而不会产生明显的临床异常[3]。
2022年，Genes (Basel) 杂志上发表了一篇研究，作者报道了1例因PMP22基因缺失进行产前诊断家系时意外发现存在DMD基因复杂结构变异，涉及外显子51_53/64_79，内含子55，最终通过Bionano技术确定此复杂重复变异为基因外重复，未影响DMD基因功能，属于良性变异，胎儿不存在疾病发病风险[4]。
2022年，Front Genet 杂志发表一项研究，作者在两个家系中均发现DMD基因外显子56-61的重复变异，但临床表现差异很大。家系1临床拟诊SMA进行三代测序发现SMN1基因存在外显子7-8 del/c.835G > C p(G279R)复合杂合变异，患儿父母希望进一步排除更多遗传病风险，因此对这名SMA患者及其父母进行WES检测，以降低下一胎生育风险。检测结果意外发现SMA患儿父亲存在DMD基因的外显子56-61的重复变异，进一步分析发现家系中还有1名健康的男性也同样存在此重复变异，为患儿父亲的叔叔，最终通过三代测序技术确认此重复变异为基因外重复，不会影响DMD基因功能。家系2中1名男性DMD患者通过MLPA技术在检测中同样发现DMD基因的外显子56-61重复变异，通过三代测序技术确认该重复变异为DMD基因内部重复，破坏了DMD基因功能[5] 。从这两个案例中我们可以得知，虽然都是DMD基因外显子56-61的重复变异，但更深入确认是否破坏DMD基因功能，才是有没有临床表型的关键。
二
检测方法
01
多重连接探针扩增
DMD基因常见变异为缺失或重复变异，可通过多重连接探针扩增 (multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技术进行检测。相关检测试剂盒针对每个外显子设计了单一的探针，能够检测所有79个外显子的拷贝数变化（如图3）。外显子的重复或缺失可能发生在dystrophin基因的任何位置，其中以第45~55外显子和第2~10外显子的缺失和重复最为常见。
需要注意的是，当MLPA 仅检测到单个外显子的缺失或重复时，应采用定量的方法如荧光定量PCR (quantitative real-time PCR，Q-PCR)或定性的方法如Sanger测序加以验证，以避免探针结合序列中的点变异或多态性位点影响探针与模板的结合，从而导致假阳性或假阴性的结果。对于MLPA 检测到的外显子不连续缺失或重复，需进行进一步的验证(比较基因组杂交或RNA 分析)，以排除基因组内单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNP)导致引物无法结合所产生的假结果。
比如在2016年的文章中，作者在75个DMD基因单外显子缺失重复的患者中发现11个患者为SNP导致的假阳性[6]。
02
NGS技术、Sanger测序方法
若MLPA等方法未检测到DMD基因缺失或重复变异，而临床高度怀疑为肌营养不良蛋白病时，则需要采用测序的方法检测DMD基因的点变异或小的插入及缺失(即微小变异)。Sanger测序是检测dystrophin基因外显子微小变异的常规方法，该方法虽然准确但耗时耗力，目前临床广泛采用的是高通量测序技术，最常见的是靶向NGS (amplicon-based targeted NGS)，该方法能对dystrophin基因的所有79个外显子以及邻近的内含子区进行测序，此外,全外显子组测序 (whole exome sequencing, WES)、全基因组测序 (whole genome sequencing, WGS)也在dystrophin基因检测中逐渐得到应用。
03
RNA分析
在2021年的一篇研究中，作者通过对患者进行全基因组检测和尿液细胞RNA分析，发现了3个常规检测策略无法发现的变异，均导致了DMD基因的异常剪切[7]。
参考文献：
[2] Melis M A , Cau M , Muntoni F ,et al. Elevation of serum creatine kinase as the only manifestation of an intragenic deletion of the dystrophin gene in three unrelated families.[J].European Journal of Paediatric Neurology, 1998, 2(5):255-261
[3]AknorNakamura,NooruFuk,NaokoSha,et al. Deletion of exons 3−9 encompassing a mutational hot spot in the DMD gene presents an asymptomatic phenotype, indicating a target region for multiexon skipping therapy[J].Journal of Human Genetics, 2016.
[4]Du J .Reclassification of DMD Duplications as Benign: Recommendations for Cautious Interpretation of Variants Identified in Prenatal Screening[J].Genes, 2022, 13.
[6] Kim M J , Cho S I , Chae J H ,et al.Pitfalls of Multiple Ligation-Dependent Probe Amplifications in Detecting DMD Exon Deletions or Duplications[J].Journal of Molecular Diagnostics, 2016, 18(2):253-259.DOI:10.1016/j.jmoldx.2015.11.002.
[7] Falzarano M S , Grilli A , Zia S ,et al.RNA-seq in DMD urinary stem cells recognized muscle-related tranion signatures and addressed the identification of atypical mutations by whole-genome sequencing[J]. 2021返回搜狐，查看更多